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L’HPTLC est une technique très flexible. La plaque se déplace à travers les étapes du processus avec des paramètres réglables, et le niveau d’automatisation augmente avec la demande de résultats précis.

Application
Le dépôt des échantillons et des témoins est la première étape du flux de travail de l’HPTLC et elle affecte de manière significative la qualité du résultat à la fin du processus. Le choix de la technique d’application et de l’appareil dépend des exigences de précision, des volumes d’échantillons, du nombre d’analyses et du degré d’automatisation souhaité.
L’application de bandes par la technique de pulvérisation, en utilisant le module HPTLC PRO APPLICATION, l’Automatic TLC Sampler 4 (ATS 4), ou le Linomat 5 permet l’application optimale des échantillons. Les zones de départ sous forme de bandes étroites garantissent la meilleure résolution, grâce à une meilleure focalisation des produits dans la silice. Les instruments haut de gamme sont équipés d’une buse de pulvérisation qui permet d’optimiser l’effet de pulvérisation en fonction du solvant d’échantillon utilisé.
De très grands volumes d’échantillons ou des échantillons à forte teneur en matrice peuvent être pulvérisés sous forme de rectangles avec l’Automatic TLC Sampler 4 (ATS 4) qui, avant la migration, sont concentrés en bandes étroites par une courte étape de développement avec un solvant de force d’élution élevée. L’application d’échantillons à l’aide d’un capillaire à volume fixe est la méthode la plus simple et la plus économique et est généralement utilisée pour la CCM manuelle . Des volumes d’échantillons de 0,5 à 5 μL peuvent être appliqués. Il est recommandé de guider le capillaire à l’aide du Nanomat 4.

Développement
La migration est l’étape clé de l’HPTLC pour séparer avec précision les substances d’un échantillon. La chambre sélectionnée et la configuration de la chambre jouent un rôle important en ce qui concerne la qualité de la séparation et la reproductibilité de la chromatographie. Outre la phase stationnaire et la phase mobile, l’HPTLC comporte une phase gazeuse, qui peut influencer de manière significative le résultat de la séparation. Un développement peut se produire dans une chambre non saturée, partiellement saturée, saturée et/ou préconditionnée.
L’objectif principal d’une chambre automatique (HPTLC PRO Module DEVELOPMENT, Automatic Developing Chamber 2 (ADC 2) ou AMD 2 System Automated Multiple Development) est de rendre le développement plus reproductible et indépendant de l’interaction humaine. Avec une chambre automatique, l’activité de la phase stationnaire peut être ajustée. La silice est automatiquement mise en contact avec la phase mobile et la migration est surveillée. Une fois la chromatographie terminée, la plaque est séchée.
Dans le cas du module HPTLC PRO DEVELOPMENT, la phase gazeuse (du solvant de développement ou du solvant alternatif) peut même circuler activement pendant la migration pour améliorer la séparation des composés.
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Dérivatisation
L’un des avantages inhérents à l’HPTLC est que tous les composés restent stockés sur la plaque et peuvent être facilement dérivés après la chromatographie. Les composés qui ne réagissent pas à la lumière visible ou UV peuvent être rendus détectables. Dans de nombreux cas, les composés ou les classes de composés peuvent être identifiés par des réactifs spécifiques, ce qui permet leur détection sélective.
Pour le transfert de réactifs liquides pour la dérivatisation post-chromatographique, on peut choisir entre la pulvérisation et le trempage. LLa pulvérisation automatique (HPTLC PRO Module DERIVATIZATION, Derivatizer) ou l’immersion (Chromatogram Immersion Device 3) sont les techniques préférées, en particulier lorsqu’une évaluation quantitative est prévue.
La dérivatisation pré-chromatographique est également possible en pulvérisant les zones d’application de l’échantillon avec le Linomat 5, l’Automatic TLC Sampler 4 (ATS 4) ou l’HPTLC PRO Module APPLICATION.
Dans la plupart des cas, la réaction de dérivatisation doit être complétée par un traitement thermique. Il est fortement recommandé de chauffer la plaque à la température souhaitée à l’aide d’une plaque chauffante (TLC Plate Heater 3) spécialement conçu à cet effet. Une unité de chauffage de plaque fait partie intégrante du module HPTLC PRO DERIVATIZATION.

Détection
Contrairement à d’autres techniques chromatographiques, l’HPTLC offre la possibilité unique de « visualiser » le résultat chromatographique directement à l’œil nu.
Les substances colorées peuvent être vues directement sur la plaque ; d’autres sont facilement transformées en dérivés colorés.Les composés qui absorbent la lumière UV à 254nm sont visualisés à l’aide d’une plaque imprégnée d’un indicateur de fluorescence (F254) qui apparaît sous forme de zones grises à noires sur cette plaque, tandis que le reste de la plaque reste fluorescent.
Les substances excitées à la fluorescence par l’UV 366 nm, avec ou sans dérivatisation, peuvent également être visualisées. Pour l’acquisition électronique des images, une caméra numérique capture la lumière polychromatique visible. Les données obtenues peuvent être éditées, archivées et évaluées.
Pour la quantification, on peut utiliser des données hyperspectrales (HPTLC PRO Module DETECTION), des densitogrammes (TLC Scanner 4) ou des profils d’image (TLC Visualizer 3). Les données hyperspectrales sont obtenues en utilisant une lumière polychromatique pour l’excitation en conjonction avec un spectromètre d’imagerie (HPTLC PRO Module DETECTION).
Les densitogrammes sont obtenus en balayant la plaque avec une lumière monochromatique et en détectant la lumière réfléchie avec un photomultiplicateur (TLC Scanner 4). Les images sont capturées avec une caméra CCD tricolore (TLC Visualizer 3). La sélectivité spectrale offre un grand avantage par rapport à l’inspection visuelle. Chaque composé individuel peut être évalué à son maximum d’absorption/fluorescence. En outre, les spectres UV des composés séparés peuvent être enregistrés et utilisés à des fins d’identification.
Pour la confirmation de la structure, les composés cibles sélectionnés peuvent être transférés vers un spectromètre de masse (voir MS-Interface). Une analyse non ciblée peut être réalisée par des tests d’activités biologiques en HPTLC, par exemple la toxicité de base pour Alliivibrio fischeri analysée par détection de bioluminescence (BioLuminizer 2).

Interface MS
Le couplage HPTLC-MS permet de vérifier la structure chimique des composés par spectrométrie de masse. Les composés peuvent être directement élués avec la MS-INTERFACE (HPTLC PRO Module MS-INTERFACE ou TLC-MS Interface 2) depuis la plaque et injecté directement en masse ou collecté pour une analyse offline ultérieure.

Stockage des plaques
Le module HPTLC PRO permet d’alimenter et de stocker automatiquement les plaques HPTLC dans le HPTLC PRO SYSTEM.
Doté de deux empileurs pour cinq plaques de verre HPTLC propres et cinq plaques traitées (20 × 10 cm) chacun, le module HPTLC PRO PLATE STORAGE permet le fonctionnement autonome du HPTLC PRO SYSTEM. Il est essentiel pour le développement séquentiel de plusieurs plaques (le module APPLICATION peut contenir jusqu’à 75 échantillons) en fournissant au HPTLC PRO SYSTEM des plaques propres et en stockant les plaques traitées pendant ou après l’analyse.
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